一、实验目的

1. 解决餐厨垃圾发酵液高浊度条件下悬浮颗粒物、菌体、油脂、有机酸、盐类对Kibron张力测试的干扰，建立可复现的多层级空白校正操作方法。

2. 区分悬浮颗粒物理干扰与溶解性生物表面活性剂的真实界面效应，得到校正后真实动态表面张力曲线。

3. 统一仪器基线空白、基质空白、过滤基质空白三类对照，减少浊度带来的数据漂移、数值虚降、曲线抖动问题。

4. 形成高浊有机发酵液Kibron测试标准化操作流程，用于发酵过程界面活性变化监测。

二、仪器材料与试剂准备

1. 仪器

芬兰Kibron榴莲视频APP下载，EZ‑Pi Plus单通道或者Delta‑8高通量机型，配备DyneProbe铂铱探针，温控样品台，配套Kibron分析软件。高速冷冻离心机，真空脱气装置，pH计，浊度计，超纯水机。

2. 试剂与样品

不同发酵阶段餐厨垃圾发酵原液，超纯水。根据发酵体系准备对应的发酵基质，不含餐厨垃圾底物、按照相同配比配制的空白发酵基质。

3. 耗材

石英样品杯或者96孔DynePlate微孔板，低吸附离心管，无水乙醇，0.45μm水系滤膜，0.22μm水系滤膜。滤膜提前用基质溶液润洗，降低滤膜吸附损失。

4. 仪器前期校验

仪器放置无震动、避开气流直吹台面，整机通电预热60min，闭合防风罩。探针依次超纯水冲洗，无水乙醇冲洗，高纯氮气吹干。25℃超纯水做张力标定，纯水表面张力稳定72.0‑72.8mN/m，通道之间偏差小于0.2mN/m，基线稳定无漂移。测试温度固定25.0±0.5℃。

三、四类空白的定义与样品制备

1. 仪器基线空白

使用18.2MΩ超纯水，0.22μm过滤、真空脱气10‑15min。用于校验仪器硬件零点，每次整套实验开始和结束均需要测定，不用于样品数据直接扣除，用于判断探针、样品杯是否存在污染。

2. 原始基质空白

按照餐厨垃圾发酵的原始配方，配制不含餐厨垃圾底物的发酵基质，和实验组同步接种、同步发酵，经历完全相同的培养周期。该空白含有发酵产生的盐、有机酸、接种微生物代谢背景，保留体系全部溶解态背景组分，浊度来源于接种污泥菌体。用于反映发酵体系本身带来的界面背景。

3. 过滤基质空白

将上述原始基质空白经过高速离心，再依次0.45μm、0.22μm滤膜过滤，去除全部悬浮颗粒，得到澄清基质空白溶液。该空白消除悬浮颗粒干扰，保留全部溶解性组分，用于区分颗粒物理干扰和溶解性物质界面活性。

4. 样品平行分组

每个发酵时间点准备三份样品，第一份为未过滤高浊发酵原液；第二份发酵液8000g离心20min取上清；第三份离心上清再经过0.45μm、0.22μm逐级过滤得到澄清滤液。每个组别设置2‑3份技术平行。所有样品配制完成后真空脱气10‑15min，目视检查无气泡。如果不能立即上机，4℃避光保存，存放不超过24h。

四、完整上机测试操作流程

1. 软件参数设置

新建动态表面张力时间扫描程序，测试温度设置25℃，总采集时间设置90‑120min，保证张力达到稳定平台。采集间隔2‑5秒每数据点，探针下降速度2mm/min，探针浸入液面深度0.3mm。

2. 空白样品优先测试顺序

先测定仪器基线空白超纯水，确认基线正常。接着测定过滤基质空白，采集完整动态张力曲线。再测定原始基质空白高浊样品，记录高浊基质带来的曲线抖动、漂移特征。全部空白测试完成后，再测定餐厨垃圾发酵液各组样品。

3. 单通道石英杯上样操作

取150‑200μL待测样品，沿杯壁缓慢加入石英样品杯，严禁冲击液面产生气泡。将样品杯放置温控台，关闭防风罩静置8‑10min，消除上样扰动。探针下降接触气液界面，启动采集，记录完整动态张力‑时间曲线。

如果使用Delta‑8高通量96孔板模式，每孔加入50μL样品，仔细检查孔内无气泡，将微孔板卡紧固定，启动批量自动测试。空白样品与待测样品排布在同一块微孔板，保证温度、环境条件完全一致。

4. 探针清洗流程

每完成一个样品测试，探针超纯水冲洗3次，无水乙醇冲洗，高纯氮气吹干。高浊发酵液含有油脂、有机质，极易吸附在探针表面，高浊样品测试结束后，可短时间乙醇浸泡探针再冲洗吹干，消除吸附残留，防止交叉污染。

五、分层空白校正数据处理步骤

1. 导出全部原始动态张力数据，首先查看仪器基线空白，若纯水基线漂移大于0.2mN/m，判定探针或样品杯被污染，本次数据作废，重新清洁探针样品杯复测。

2. 处理澄清滤液数据。将发酵液澄清滤液原始曲线，扣除同批次过滤基质空白曲线，得到校正后溶解性组分的真实表面张力变化，该结果消除盐、有机酸等可溶性基质背景的影响。

3. 处理高浊未过滤原液数据。高浊原液不能直接简单做单点数值相减。对比原始基质空白（高浊）与发酵原液的曲线形态，区分两种干扰。

曲线整体持续漂移、高频抖动，主要来自悬浮颗粒碰撞探针、颗粒在界面沉降，属于物理干扰，不能直接用数值相减消除，需要以澄清滤液校正结果作为参考，评价原液数据可信度。

曲线出现稳定的张力平台下降，抖动幅度小，代表体系存在溶解性表活物质，此时以澄清滤液校正结果作为主要参考指标，原液曲线作为辅助参考。

4. 浊度关联校验。同步测定各样品浊度，记录NTU数值。同一个发酵时间点对比原液、离心上清、过滤滤液三组张力结果。如果过滤前后张力差异巨大，说明悬浮颗粒对测试贡献显著，不能直接采用未过滤原液单点张力数值作为结论。

5. 平行统计，计算校正后各组平衡表面张力、张力下降速率，统计平均值与标准偏差。

六、关键细节与质量控制

1. 餐厨垃圾发酵液含有浮油，油脂会在探针、液面富集，带来严重假张力下降，样品取样尽量避开上层浮油层。如果样品浮油明显，需要离心去除浮油后再开展测试。

2. 滤膜存在有机物质吸附，基质空白必须经过和样品完全相同的滤膜润洗、过滤流程，不能直接使用未过滤基质做滤液的扣除空白。

3. 高浊样品悬浮颗粒会缓慢沉降，上样静置时间要统一，静置时间不一致会造成颗粒沉降程度不同，带来读数差异。

4. 不可以直接用纯水作为发酵液的扣除空白，发酵基质本身含有大量挥发性脂肪酸、盐类，会改变基础表面张力，必须使用同批次发酵基质空白。

5. 全程严控气泡，微小气泡会造成曲线剧烈抖动，高浊样品气泡目视不容易分辨，出现曲线无规则剧烈震荡，优先怀疑气泡干扰，重新制样复测。

6. 环境温度波动控制在±1℃以内，温度变化会直接改变表面张力数值。