一、实验目的
1. 建立Kibron仪器检测益生菌发酵液动态表面张力、计算AUC张力面积的标准化可复现操作流程，整合界面吸附速率、吸附总量、平衡张力多维度信息，弥补单一平衡张力参数的局限性。
2. 精准获取不同益生菌菌株、不同发酵周期发酵上清的AUC张力面积参数，量化菌株代谢界面活性物质的综合能力。
3. 同步开展益生菌体外益生潜力检测，构建AUC张力面积与菌株黏附、抑菌、乳化等益生功能的关联体系。
4. 建立理化界面参数结合功能指标的益生菌筛选、发酵工艺优化评价体系。
二、仪器材料与试剂准备
1. 仪器
芬兰Kibron榴莲视频APP下载，可选EZ‑Pi Plus单通道、Delta‑8高通量机型，配套DyneProbe铂铱探针、温控样品台及专用分析软件。配备高速冷冻离心机、真空脱气装置、精密pH计、超纯水机、恒温摇床，数据处理设备用于梯形法AUC积分计算。单通道适配3640型号PTFE样品杯，高通量适配DynePlate 96孔微孔板。
2. 试剂与样品
待测益生菌菌株，包含乳杆菌、双歧杆菌等常用功能菌株，配套专用液体发酵培养基。设置未接种、同步孵育的空白培养基对照组。配备益生菌体外益生潜力检测所需试剂，病原菌菌株、细胞培养体系、乳化测试用油相等。所有培养基提前真空脱气10至15分钟，去除溶解气泡干扰。
3. 耗材
无菌低吸附离心管、无水乙醇、0.22μm低吸附水系滤膜、无菌低吸附移液枪头。滤膜需提前用对应发酵培养基润洗，避免吸附益生菌胞外多糖、脂肽等活性物质，减少实验误差。
4. 仪器校验准备
将仪器放置在无震动、无空调直吹的平稳台面，整机通电预热60分钟，全程关闭防风罩。铂铱探针依次用超纯水冲洗、无水乙醇冲洗、高纯氮气吹干，检查探针尖端无弯折、无残留污渍。在25℃恒温条件下完成纯水张力校准，纯水表面张力稳定在72.0至72.8mN/m，仪器通道偏差小于0.2mN/m，基线无漂移即为校验合格。统一设定实验测试温度为25.0±0.5℃。
三、益生菌发酵液样品制备
1. 菌株培养取样
将保存的益生菌菌株常规活化处理，转接至液体发酵培养基，设置标准摇床发酵条件，每组菌株设置3组生物学平行样本。同时设置未接种的空白培养基，与实验组在相同条件下同步孵育。按照实验梯度，分别在0h、12h、24h、36h、48h进行定点取样。
2. 样品预处理
采集的菌液置于高速冷冻离心机，8000g离心20分钟，彻底去除菌体细胞与沉淀杂质，缓慢吸取上层澄清上清液。使用提前润洗好的0.22μm低吸附滤膜对上清液过滤，去除微小残留颗粒。全程操作轻柔，禁止剧烈涡旋震荡，防止产生气泡或破坏活性物质结构。
3. 样品分组与保存
实验样品分为各组益生菌发酵上清液、同批次空白培养基对照组。单通道测试样品体积控制在150至200μL，高通量96孔板每孔加样50μL。样品遵循现提现测原则，益生菌代谢活性物质稳定性较弱，若需短期存放，4℃避光保存不超过12小时，上机前恢复至室温。
4. 样品平衡处理
过滤完成的待测样品与空白样品，室温静置平衡30分钟，使液面状态、溶液组分完全稳定。目视检查样品无沉淀、无气泡，存在气泡的样品需重新制备。
四、Kibron上机完整操作流程
1. 软件参数设置
新建动态表面张力时间扫描测试方案，恒定测试温度25℃。根据益生菌界面吸附特性，设置总采集时长90至120分钟，完整覆盖吸附全过程，保证曲线达到平衡平台，满足AUC积分计算要求。数据采集间隔2至5秒每点，探针下降速度2mm/min，探针液面浸入深度固定0.3mm，每个样品设置2次技术重复。
2. 上样操作
单通道测试取150至200μL发酵上清液，沿PTFE样品杯杯壁缓慢加样，避免冲击液面产生气泡。将样品杯固定在温控样品台，关闭防风罩静置8至10分钟，消除移液扰动。待液面完全稳定后，控制探针下降接触气液界面，启动数据采集，全程记录动态张力变化曲线。
高通量96孔板测试，每孔缓慢加入50μL样品，避免触碰孔壁与液面。加样完成后逐孔检查，剔除含气泡微孔，将微孔板固定卡槽，将待测样品与空白样品均匀排布在同一板内，统一环境条件，启动批量自动测试。
3. 探针清洗流程
单个样品测试完成后，探针依次用超纯水冲洗3次、无水乙醇冲洗、高纯氮气吹干。益生菌发酵液中的蛋白、脂肽、多糖极易吸附在探针表面，必须彻底清洗，避免交叉污染。全部样品测试结束后，用无水乙醇短暂浸泡探针，再次冲洗吹干后保存。
4. 测试顺序
严格按照基线校准、空白测试、样品测试的顺序操作。先检测超纯水基线，确认仪器状态正常，再测试同批次空白培养基，最后检测各组益生菌发酵上清样品。所有测试完成后复测超纯水，若纯水张力偏差大于0.2mN/m，说明探针存在残留污染，本组数据作废，深度清洗探针后重新实验。
五、数据处理、AUC张力面积计算与益生潜力关联分析
1. 整理仪器导出的原始动态张力数据，对比实验前后超纯水基线数值，基线漂移超0.2mN/m的样本数据全部剔除。
2. 以同批次空白培养基张力曲线为基准，扣除基质本底干扰，得到校正后益生菌发酵液动态表面张力-时间变化曲线，保证数据仅反映菌株代谢活性物质的界面作用。
3. 采用梯形积分法对完整时间段的校正曲线进行积分计算，得到AUC张力面积，单位为mN·m⁻¹·min。AUC数值越小，代表菌株代谢产物界面活性越强，界面吸附效率越高、张力下降效果越显著。同步提取初始表面张力、平衡表面张力、张力下降速率参数，计算所有平行样本的平均值与标准偏差。
4. 采用同一批次发酵样品开展体外益生潜力检测，可检测指标包含细胞黏附率、病原菌抑菌活性、溶液乳化指数、菌体自聚集与共聚集能力等，量化各组菌株的益生功能水平。
5. 将各组菌株的AUC张力面积与益生潜力指标一一匹配，绘制相关性散点图，开展统计学相关性分析。结合菌株代谢特性，区分界面活性物质与有机酸等组分对益生功能的贡献，明确AUC张力面积评价益生菌益生潜力的适配规律。
六、关键细节与质量控制
1. AUC张力面积为全周期积分参数，必须保证测试时长完整、曲线达到平衡状态，禁止截取局部时间段计算积分，无法真实反映菌株整体界面活性。不可用单一平衡张力数值替代AUC参数。
2. 界面张力测试与益生功能检测必须使用同一批次样品，缩短两项实验的时间间隔，避免活性物质降解导致理化数据与功能数据不匹配。
3. 滤膜必须提前用发酵培养基润洗，有效降低滤膜对益生菌活性代谢产物的吸附损耗，保证测试数据真实准确。
4. 全程严控气泡产生，微量体系气泡隐蔽性强，若曲线出现无规则高频抖动，判定为气泡干扰，需重新制备样品测试。
5. 实验环境温度波动控制在±1℃以内，实验台面保持绝对平稳，避免震动干扰液面状态，降低曲线噪音，保障AUC积分计算精度。
6. 严格控制测试时长不超过120分钟，实验环境湿度维持40%至60%，减少溶剂挥发造成的样品浓度漂移，避免数据失真。
